Вопросы воспроизводимости результатов измерения содержания эндотоксинов
25.01.2023
Демидова В.В. – Руководитель Испытательной лаборатории ООО «НПО «ЛАЛ-Центр»
Ожерельева А.С – Руководитель Организационного отдела Испытательной лаборатории ООО «НПО «ЛАЛ-Центр»
Вопрос оценки сходимости результатов измерений содержания эндотоксина – частый вопрос, возникающий при сравнении результатов, полученных в разных лабораториях или даже в одной лаборатории в разное время, в разных опытах. Основное объяснение значительного разброса результатов измерений заключается в том, что ЛАЛ-тест – это биологический анализ, для которого характерна высокая зависимость результатов от множества факторов, влияющих на активность ферментной системы и активность эндотоксинов во время анализа.
Для того, чтобы оценить каким может быть возможный разброс результатов в анализах, проводимых в максимально схожих условиях, были поставлены несколько демонстрационных опытов, задачей которых было проиллюстрировать, каким может быть естественный разброс результатов. В каждом из проведенных опытов какая-то часть условий проведения испытания была предельно унифицирована так, чтобы по возможности максимально снизить влияние факторов, способных оказать влияние на отклонение результатов.
В качестве объекта проверки был выбран образец воды для гемодиализа с небольшим фоновым содержанием эндотоксинов. Причина выбора была очевидной – среда, в которой определяется эндотоксин, должна быть максимально нейтральной, она не должна оказывать никакого ингибирующего воздействия на ЛАЛ-реактив. Проще воды для инъекций в этом смысле не найти. Также нужно, чтобы содержащийся в образце эндотоксин имел естественную природу, такие природные эндотоксины очень стабильны, и их концентрация в растворе не меняется во время хранения. Дополнительный плюс по выбранному образцу - эти образцы (вода для инъекций или вода для гемодиализа) можно проверять без дополнительного разведения, поскольку образец не ингибирует реакцию, а ожидаемая концентрация эндотоксина находится внутри диапазона калибровочной кривой. Возможность проверки без разведения так же снижает возможность ошибки измерения, связанную с разведениями или манипуляциями с испытуемым образцом.
В этих примерах оценку содержания эндотоксинов проводили с помощью инструментальных анализов, количественные результаты которых дают хорошую возможность статистического сравнения результатов. Калибровочная кривая выбрана была с диапазоном 0,05 - 5 ЕЭ/мл. Короткий диапазон по трем точкам обычно дает хорошую линейность.
Были проведены два опыта, в которых проверялся один и тот же образец, анализы ставили одним и тем же методом с использованием ЛАЛ-реактива одной и той же серии.
Разница между двумя экспериментами заключалась в следующем:
В первом опыте по одной калибровочной кривой измеряли содержание эндотоксинов в образце в пяти повторах.
Во втором опыте тот же образец проверяли по двум калибровочным кривым, при том что оба эти измерения были проведены на одном планшете и в одно икубирование.
Опыт 1. Параллельная проверка одного и того же образца в одном опыте в нескольких повторах.
Проводили измерение содержания эндотоксина в одном и том же образце в пяти разных повторах. Была подготовлена одна калибровочная кривая.
Условия, которые можно считать одинаковыми в этом опыте:
· Одно оборудование, используемое одномоментно.
· Один планшет, в котором проводится инкубирование.
· Проверка по одной калибровочной кривой.
· Опытный образец не разводится, проверяется напрямую.
· Один и тот же сотрудник готовит растворы для калибровки.
· Один и тот же набор дозаторов для дозирования растворов.
· Для проверки используется одна и та же серия ЛАЛ-реактива.
Что можно отнести к отличиям:
· Индивидуальное дозирование испытуемых растворов в лунки планшета.
Результаты
Оценка результатов по критериям достоверности калибровочной кривой
Таблица №1
Калибровка |
Коэффициент корреляции |r| |
Допустимое значение |
Соответствие |
Калибровочная кривая |
-1,0000 |
-≤0,980 |
Соответствует |
Коэффициент корреляции калибровочной кривой оказался очень высоким.
Время реакции по каждому образцу
Таблица №2
Образец (повтор) |
1 Время реакции, сек |
2 Время реакции, сек |
Среднее время реакции, сек |
CV,% |
1 |
1328,4 |
1329,7 |
1329,1 |
0,05 |
2 |
1337,8 |
1333,1 |
1335,5 |
0,18 |
3 |
1357,9 |
1335,0 |
1346,5 |
0,85 |
4 |
1348,1 |
1335,0 |
1341,6 |
0,49 |
5 |
1296,2 |
1310,6 |
1303,4 |
0,55 |
Обращаем внимание на то, что в каждой паре измерений разброс результатов очень незначительный, хотя среднее время реакции для каждого образца отклоняется в пределах 40 секунд, что уже довольно большая разница.
Значение концентрации эндотоксинов, среднее значение, отклонения.
Таблица №3
Образец (повтор) |
Концентрация БЭ, ЕЭ/мл |
1 |
0,6186 |
2 |
0,6037 |
3 |
0,5790 |
4 |
0,5899 |
5 |
0,6831 |
|
|
Среднее значение |
0,6149 |
СКО |
0,04 |
CV,% |
6,7 |
Анализ проводился в максимально идентичных условиях, тем не менее результаты концентрации для пяти измерений показали довольно большой разброс результатов – 6,7%.
С точки зрения аналитики на результат могла повлиять точность и прецизионность дозирования образца в лунки планшета. Остальные показатели и параметры были одинаковы для всего опыта. По точности и прецизионности дозирования можно обратиться к нормативам для дозаторов. Так по ГОСТ 28311-2021 прецизионность выраженная в относительной величине рассеяния результатов (стандартного отклонения) относительно величины среднего результата для дозы 100 мкл (стандартной дозой испытуемого образца при составлении реакционной смеси) не должна превышать 2%. Т.е. погрешность при дозировании реакционной смеси составляет менее 2%, а результат измерения содержания бактериальных эндотоксинов при этом имеет разброс 6,7%.
Опыт 2. Один образец в параллели по двум калибровкам в одном опыте
Проводили измерение содержания эндотоксина в одном и том же образце в опыте, в котором для каждого образца строится своя калибровочная кривая. При этом обе калибровки и обе проверки проводились в одном планшете и в одно инкубирование. Это дало возможность провести два параллельных измерения при абсолютно одинаковых условиях подготовки калибровочных растворов и условиях инкубирования/измерения.
Условия, которые точно можно считать одинаковыми в этом опыте:
-
Одно оборудование, используемое одномоментно.
- Один планшет, в котором проводится инкубирование.
-
Растворы КСЭ для калибровочной кривой приготовлены в один проход и применялись для обеих калибровок.
-
Опытные образцы не разводятся, проверяются напрямую.
-
Один и тот же сотрудник готовит растворы для калибровок.
-
Один и тот же набор дозаторов для дозирования растворов.
-
Для проверки используется одна и та же серия ЛАЛ-реактива.
Что можно отнести к отличиям:
-
Дозирование контрольных растворов для каждой калибровочной кривой индивидуальное.
-
Дозирование образцов в лунки планшета – индивидуальное.
Результаты
Оценка результатов по критериям достоверности калибровочных кривых
Таблица №4
Калибровка № |
Коэффициент корреляции |r| |
Slope |
Y-intercept |
Время реакции (RT) в сек. для концентрации 1 ЕЭ/мл |
Калибровочная кривая 1 |
-1,0000 |
-0,1999 |
3,0761 |
1191,516 |
Калибровочная кривая 2 |
-1,0000 |
-0,2004 |
3,0743 |
1186,588 |
Сходимость калибровочных кривых оказалась очень высокой. Ниже на диаграмме мы вывели обе кривые на одной координатной сетке. Увидеть разницу расхождения кривых (синяя и оранжевая линии) практически невозможно.
Диаграмма №1
Собственно, этого и следовало ожидать – обе калибровки делались по одним растворам КСЭ, использовался ЛАЛ-реактив одной серии, из одного флакона, разведенный перед опытом.
Совпали не только линейность, но и значения пересечения с осью Y, почти до секунд. Для демонстрации в последней колонке в таблице №4 выведено время реакции (RT) для концентрации 1 ЕЭ/мл, разница составила всего пять секунд. Обе калибровки практически совпали, тем интереснее смотреть на результаты измерения для одного и того же образца по этим двум калибровкам.
Содержание эндотоксинов, измеренное в образце по разным калибровочным кривым
Содержание бактериальных эндотоксинов в двух образцах по двум калибровочным кривым
Таблица №5
Калибровка № |
Содержание эндотоксина, ЕЭ/мл |
Калибровочная кривая 1 |
0,3571 |
Калибровочная кривая 2 |
0,4354 |
Разницу значений определила разница времени реакции – одинаковая концентрация эндотоксина в образце прореагировала с одним и тем же ЛАЛ-реактивом за разное время.
Таблица №6
Калибровка № |
1 Время реакции, сек |
2 Время реакции, сек |
Средне время реакции, сек |
CV, % |
Калибровочная кривая 1 |
1471,4 |
1456,5 |
1463,95 |
0,51 |
Калибровочная кривая 2 |
1415,0 |
1388,2 |
1401,6 |
0,96 |
Обращаем внимание на то, что в каждой паре измерений разброс результатов очень незначительный, примерно такой же как и в первом опыте, коэффициент вариации времени реакции не превышает 1%. Разница же значений времени реакции для каждого образца составила уже существенные 60 секунд.
Для двух измерений содержания эндотоксинов полученные результаты можно обобщить следующим образом:
Таблица №7
Среднее значение по 2 измерениям, ЕЭ/мл |
0,3963 |
СКО |
0,0553 |
CV, % |
14 |
При том, что анализ проводился в максимально идентичных условиях, результаты концентрации в двух измерениях показали уже довольно большой относительный разброс результатов, коэффициент вариации составил 14%.
Обобщение результатов по опытам 1 и 2
Всего было проведено 7 измерений концентрации эндотоксина для одного и того же образца. Измерения проводились в двух опытах, одним методом, на одном оборудовании и с помощью одно и того же ЛАЛ-реактива (одной серии).
Суммарная таблица результатов.
Таблица №8
Измерение |
Опыт 1, ЕЭ/мл |
Опыт 2, ЕЭ/мл |
Опыты 1 и 2, ЕЭ/мл |
1 |
0,6186 |
0,6186 |
|
2 |
0,6037 |
0,6037 |
|
3 |
0,5790 |
0,5790 |
|
4 |
0,5899 |
0,5899 |
|
5 |
0,6831 |
0,6831 |
|
6 |
0,3571 |
0,3571 |
|
7 |
0,4354 |
0,4354 |
|
Среднее значение, ЕЭ/мл |
0,6149 |
0,3963 |
0,5524 |
СКО |
0,04 |
0,06 |
0,11 |
CV, % |
6,7 |
14,0 |
20,6 |
Стоит обратить внимание на значение коэффициента вариации, СV, это относительная величина, выраженная в процентах.
Наименьшее значение коэффициента вариации получено в самой очевидной ситуации – по одной калибровке пять раз измерили один и тот же образец. И даже при такой, казалось бы, полностью унифицированной схеме проверки разброс результатов составил целых 6,7%.
В опыте с двумя измерениями по двум калибровкам при значительной унификации условий измерения, давших очень высокую сходимость характеристик калибровочных кривых – одна и та же серия разведений КСЭ, использованная для построения калибровочных кривых, анализ в одном планшете и в одно инкубирование – разброс результатов составил уже 14%.
Наконец, при сравнении всех результатов, полученных в этих двух опытах в двух инкубированиях, проведенных в разное время, разброс результатов выходит уже на привычные нам 20-35%. Это довольно большой разброс результатов, укладывающийся правда в допустимую погрешность измерения. Так, если принять среднее значение для 7 измерений равное 0,5524 ЕЭ/мл за истинное значение, среднее отклонение составило 20,6%, а разброс максимального/минимального результатов был больше и оказался ближе к классическому интервалу 50-200% от измеренной величины.
Таблица №9
Измерение |
Содержание БЭ, ЕЭ/мл |
В % от среднего значения |
1 |
0,6186 |
112% |
2 |
0,6037 |
109% |
3 |
0,5790 |
105% |
4 |
0,5899 |
107% |
5 |
0,6831 |
124% |
6 |
0,3571 |
65% |
7 |
0,4354 |
79% |
Среднее значение |
0,5524 |
100% |
мин |
0,3571 |
65% |
макс |
0,6831 |
124% |
Нам кажется, что приведенные примеры помогают понять почему в опытах, проводимых при контролируемых условиях, на поверенном и калиброванном оборудовании могут получаться результаты по содержанию бактериальных эндотоксинов сильно отличающиеся друг от друга. А также почему специалисты, кто постоянно работает с ЛАЛ-тестом, относятся к таким отличиям спокойно и не считают, что, если два результата отличаются друг от друга на десятки процентов, необходимо сразу активировать поиск причин получения OOS-результатов и начинать работу над ошибками.