Использование индикаторов эндотоксинов для верификации сложной пробоподготовки

          При проведении проверки на бактериальные эндотоксины сложного препарата, представляющего собой суспензию цефалоспоринового антибиотика в масле, возникла проблема с пробоподготовкой. Попытка добавить воду и получить раствор препарата, который можно было бы поставить в опыт привела к формированию бесформенного осадка. Для анализа препарат надо развести в 4000 раз (с имеющимся лал-реактивом определенной чувствительности), но выпадение осадка – это очень высокий риск потери определяемой концентрации эндотоксина, поэтому прямое разведение исходного препарата водой не приемлемо.

          Из возможных решений – надо подобрать какой-нибудь проходящий растворитель, который позволил бы относительно спокойно снизить концентрацию активного вещества и масла, чтобы после этого можно было бы перейти к разведению водой.
          Были испробованы два растворителя - спирт этиловый 95% и диметилсульфоксид (ДМСО). Первые несколько шагов разведений препарата делали на растворителях, затем переходили на разведение водой.
          Оба растворителя дали приличные результаты при оценке внешнего вида растворов в степени разведения 1/10 и 1/100. Начиная с разведения 1/100 в растворителе можно уже переходить на разведения водой (не образуется осадка), сначала растворы имеют слабую опалесценцию, при дальнейшем разведении до 1/4000 раз опалесценция пропадает, и полученные растворы совершенно прозрачные.

Разведение	Спирт этиловый	ДМСО
1/10 разведение в растворителе
1/100 разведение в растворителе
Разведение водой для ЛАЛ-теста до 1/1000
Разведение водой для ЛАЛ-теста до 1/4000

          Так мы довольно быстро нашли технически приемлемое решение проведения пробоподготовки для анализа. Однако, оставался один вопрос – как такого рода обработка влияет на возможность определения эндотоксинов? Необходимо было экспериментально доказать, что сложная обработка, включающая переход масляной суспензии в водную фазу не влияет на регистрируемую концентрацию эндотоксина.
Сразу надо отметить, что само по себе использование спирта этилового и ДМСО в практике ЛАЛ-теста достаточно хорошо исследовано. Известно, что сами растворители никак не влияют на активность эндотоксинов в растворах, единственное ограничение по использованию этих растворителей – для проверки концентрация самого растворителя должна быть снижена как минимум до 5%. В нашем исследовании концентрация растворителей снижалась в 40 раз, т.е. составляла 2.5%, что вполне приемлемо для проведения анализа.
            Ответ на вопрос, какой из растворителей в данном случае может считаться более предпочтительным, можно получить после модельного эксперимента, в котором к испытуемому препарату сначала был бы добавлен эндотоксин в известной концентрации, а затем после всех процедур растворения и перевода из одной фазы в другую, эта ожидаемая концентрация эндотоксина была бы определена в опыте. Для такой работы нужны специальные очищенные препараты эндотоксина – индикаторы эндотоксина, ИЭ. Мы использовали индикаторы эндотоксина EVV2K с заявленной активностью ≥ 2000 ЕЭ/флакон (Endotoxin indicators 2 000 EU) производства Charles River Endosafe, США. Концентрация эндотоксина во флаконе нас вполне устраивала, так как общее разведение растворов должно было быть в 4000 раз, что для исходной концентрации в 2000 ЕЭ/мл давало вполне определяемую концентрацию итогового раствора примерно 0,5 ЕЭ/мл. Естественно, все измерения лучше проводить с помощью кинетических анализов. Эти анализы позволяют проводить измерение концентрации эндотоксинов в широком диапазоне (использовали калибровочную кривую 0,005 – 5 ЕЭ/мл) и опыт для параллельно приготовленных растворов можно проводить в одно измерение на одном планшете, что существенно снижает неопределенность результатов.

Общий принцип проверки.

          1. В опыте нужно оценить содержание эндотоксинов во флаконе ИЭ после разведения водой. Это будет референсное или опорное значение концентрации эндотоксина во флаконе. Для этого флакон индикатора эндотоксина разводят водой, в нашем случае 1 мл воды для ЛАЛ-теста, и опытным путем определяют полученную концентрацию эндотоксина.

Примечание. Содержание эндотоксина во флаконах ИЭ указано примерно (обычно производители пишут «не менее ХХХХ ЕЭ/во флаконе), поэтому в любом опыте необходимо поставить хотя бы один контрольный образец, разведенный водой, по которому будет определена опорная или контрольная для опыта концентрация эндотоксина.

         2. Проверяемый препарат должен быть разведён или обработан выбранным для пробоподготовки способом, но при этом до начала обработки к нему должен быть прибавлен эндотоксин в известной концентрации. После проведения обработки в полученном растворе должен определяться эндотоксин в ожидаемой концентрации.
Самый простой из возможных для нас вариантов был – добавление к двум флаконам с индикатором эндотоксина по 1 мл исходного раствора испытуемого препарата (суспензии). В результате мы получаем концентрацию эндотоксинов в испытуемом препарате эквивалентную концентрации в контрольном флаконе ИЭ, разведенным водой.
Далее один флакон ИЭ+Препарат разводили сначала спиртом этиловым, потом водой, второй – с помощью ДМСО и затем воды. Оба раствора доводили до разведений равных 1/4000, в которых и проверяли остаточную концентрацию эндотоксина.

          3. Условия приемлемости или достоверности результатов. Было принято, что обработка будет считаться приемлемой и не влияющей на результаты определения эндотоксинов в испытуемом препарате, если разница в определенной концентрации для опытных образцов будет в пределах 50-200 %.Контрольный и опытные образцы были подготовлены по описанной программе, измерение было проведено в одном опыте. Результаты сведены в таблицу, концентрация эндотоксина приведена в пересчете на исходную концентрацию во флаконе ИЭ после его разведения 1 мл воды или препаратом.

          В контрольном флаконе ИЭ концентрация эндотоксина после разведения 1 мл воды для ЛАЛ-теста оказалась выше заявленных 2000 и была равна 3 343 ЕЭ/мл.
Во флаконе ИЭ, который был разведен 1 мл испытуемого препарата и далее разводился спиртом этиловым и на конечном этапе водой для ЛАЛ-теста, была получена расчетная концентрация для исходного раствора равная 2 080 ЕЭ/мл, что составляет 62,2 % от опорной величины. Это значение может считаться приемлемым, оно укладывается в принятый нами критерий достоверности 50-200%.

          Во флаконе ИЭ, который был разведен 1 мл испытуемого препарата и затем ДМСО и водой для ЛАЛ-теста, расчетная концентрация эндотоксина оказалась равной всего 494 ЕЭ/мл, что составляет 14,78% от опорной величины. Это существенное снижение определяемой концентрации эндотоксина.

Контрольные и обработанные флаконы. Способы обработки	Концентрация эндотоксина в исходном растворе	В % от опорного значения
Индикатор эндотоксина в воде	3 343,0359 ЕЭ/мл	100
Индикатор эндотоксина + испытуемый препарат+ спирт этиловый + вода	2 080,0021 ЕЭ/мл	62,22
Индикатор эндотоксина + испытуемый препарат + ДМСО+ вода	494,0747 ЕЭ/мл	14,78

          Из двух вариантов пробоподготовки был выбран вариант с использованием спирта этилового в качестве первичного растворителя препарата – суспензии. Использование ДМСО привело к неудовлетворительным результатам, причины не понятны, но в данном опыте и не ставилась задача выяснить механизм воздействия растворителей на сложную среду, в которую добавлен эндотоксин.

          Оценить пригодность двух, внешне очень похожих вариантов пробоподготовки для проведения испытания на содержание бактериальных эндотоксинов помог модельный опыт, в котором центральную роль играли индикаторы эндотоксина. Такие индикаторы могут быть использованы для самых разных задач – от валидации процедур депирогенизации, до моделирования загрязнения сложных систем или растворов. Содержание эндотоксина в них может быть от нескольких тысяч до миллионов Единиц эндотоксина во флаконе.