Телефон: +7 (495) 517-40-37

Использование буферных растворов в ЛАЛ-тесте

15.04.2023
Использование буферных растворов в ЛАЛ-тесте

Демидова В.В. – Руководитель Испытательной лаборатории НПО «ЛАЛ-Центр»

Ожерельева А.С. – Руководитель организационного отдела Испытательной лаборатории НПО «ЛАЛ-Центр»

        

         В практике проведения ЛАЛ-теста испытатели довольно часто сталкиваются с образцами, проявляющими мешающие факторы при постановке опыта. Основным препятствием при проверке является ингибирование реакции в положительном контроле испытуемого образца, причиной чего является, но не исчерпывается, рН испытуемого раствора, выходящий за пределы (6,0 – 8,0), установленные в ОФС.1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины».

          В данной статье мы хотели подробно рассмотреть буферные растворы, предназначенные для разведения испытуемых образцов для анализа – трис-буфер (трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорид) и раствор магния сульфата в трис-буфере, первый из которых позволяет гармонизировать рН испытуемого образца с установленным в ОФС диапазоном и, в целом, улучшить среду для протекания реакции гелеобразования, а второй, при необходимости, позволяет устранить недостаток двухвалентных катионов в испытуемом растворе.

           Область применения трис-буфера в практике лабораторных биологических исследований выходит далеко за рамки применения в качестве среды подготовки разведений в ЛАЛ-тесте, так трис-буфер благодаря своей высокой буферной емкости поддерживает уровень рН раствора в диапазоне от 7,0 до 9,2, что благоприятно для проведения многих биохимических реакций и работы систем на основе ферментов в молекулярной биологии. Проведение анализа на «Бактериальные эндотоксины» также основано на реакции активации ферментативной системы из клеток мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus), для которой благоприятно нейтральное или близкое к нейтральному значению рН проверяемого раствора. Несмотря на то, что многие производители лизата амебоцитов (ЛАЛ- или ТАЛ- реактива) вводят непосредственно в состав реактива буферные компоненты, тем самым позволяя при смешивании испытуемого раствора и лизата амебоцитов добиться приемлемого уровня рН смеси и образования геля в положительном контроле образца, буферной ёмкости реактива в некоторых случаях оказывается недостаточно для преодоления ингибирования в положительном контроле. И в таком случае, испытатель может провести дополнительные шаги разведений на воде для БЭТ (вода для теста бактериальные эндотоксины) для постановки в опыт, если позволяет рассчитанное значение МДР (максимально допустимое разведение). Но как быть если получаемое разведение образца уже близко или равно МДР, а ингибирующее значение рН сохраняется, или, если в лаборатории, нет реактива с большей чувствительностью для преодоления мешающего влияния рН испытуемого образца?

          Для решения задачи проверки таких «проблемных» образцов и применяется трис-буфер, который производители выпускают в концентрациях 0,25М,  0,5М и 0,1М (0,25 моль/л, 0,5 моль/л и 0,1 моль/л соответственно). Наиболее часто в лабораторной практике ЛАЛ-теста применяется децимолярный раствор трис-буфера. Его используют как для приготовления разведения испытуемых растворов препаратов, так и для приготовления исходного раствора субстанций или вспомогательных веществ, и последующих шагов разведений полученного раствора.

          Для производителей лекарственных средств сейчас актуален вопрос о проведении входного контроля субстанций и вспомогательных веществ по показателю «Бактериальные эндотоксины», даже для таких «агрессивных» веществ как концентрированная уксусная, соляная кислоты и натриевые, калиевые щелочи. В таблице №1 приведены значения рН разведений (на воде для БЭТ и на 0,1М трис-буфере) данных растворов вспомогательных веществ и результаты возможности проверки в ЛАЛ-тесте:

Таблица 1. Результаты измерений рН и проверка в ЛАЛ-тесте концентрированных растворов вспомогательных веществ

Наименование
вспомогательного вещества

Разведение на воде для БЭТ

рН

Результат проверки

в ЛАЛ-тесте (метод С)

Разведение

на 0,1М
трис-буфере

рН

 Результат проверки

в ЛАЛ-тесте (метод С)

Калия гидроксид 10%

1/1000


10


Нет


1/10


1/50

12,5


8

Нет

Да (менее 0,25ЕЭ/мл)

Соляная кислота 37%

1/100


1/1000

0,95


1,92

Нет


Нет

1/100


1/1000

1,01


6,18

Нет


Да (менее 5 ЕЭ/мл)

Уксусная кислота 30%

1/100


1/1000

3,01


3,59

Нет


Нет

1/100 


1/1000

3,99


7,01

Нет


Да (менее 5 ЕЭ/мл)

          Другим примером улучшения свойств проверяемого образца при использовании в качестве растворителя трис-буфера при подготовке ЛАЛ-теста, является известное вспомогательное вещество, используемое в составе вакцин, анестетиков и прочих растворов для инъекций, в качестве консерванта, а также используемое в создании производных гепарина – бензэтония хлорид. 

Рисунок №1. Структурная формула бензэтония хлорида.

Бензэтония хлорид формула.jpg

           При испытании в ЛАЛ-тесте субстанция проявляет ингибирующие свойства в положительном контроле образца, вплоть до значения МДР, равного 1/1600 (при чувствительности 0,03 ЕЭ/мл лизата амебоцитов), несмотря на приемлемое значение рН испытуемого раствора (6,5 – 6,7), приготовленного на воде для БЭТ. Решением задачи проверки данного вспомогательного вещества в ЛАЛ-тесте явилось использование 0,1М трис-буферного раствора в подготовке исходного раствора и его разведений. При таком подходе ингибирование в положительном контроле испытуемого раствора преодолевается с разведения 1/200, значение рН в этом разведении также укладывается в допустимый диапазон и  равно 7,13.

           Ещё один буферный раствор, использующийся в практике ЛАЛ-теста для корректирования уровня рН и устранения недостатка двухвалентных катионов – 0,5М магния сульфат в 1,0 М Трис буферном растворе. Данный раствор актуален при проверке лекарственных препаратов, обладающий хелатирующими свойствами – т.е. способностью удерживать и создавать в испытуемом растворе дефицит двухвалентных ионов. На активацию каскада ферментов в реактиве лизата амебоцитов особенно значимое влияние имеют катионы магния (Mg2+), т.к. при их отсутствии активация ферментов происходит значительно медленнее или не происходит совсем, из-за чего эндотоксин, добавленный в положительный контроль испытуемого препарата, не обнаруживается, и проявляется ингибирование. Примером препарата, обладающего подобными свойствами удерживать катионы из испытуемого раствора, является «Терафтал» - противоопухолевый препарат, представляющий собой эфиры окта-4,5-карбокси фталоцианина кобальта общей формулы I, где R-CH3O[CH2CH2O]n или HO[CH2CH2O]n, где  n = 3-7.

Рисунок №2. Общая формула эфиров окта-4,5-карбокси фталоцианина кобальта.  

Терафтал формула.jpg

           При подготовке разведений на воде для БЭТ испытуемого раствора реакция гелеобразования в положительном контроле образца наблюдается, начиная с разведения 1/640, а при подготовке разведений на буфере магния сульфата – начиная с разведения 1/160. Таким образом, наблюдается 4-кратное улучшение «видимости» эндотоксинов в испытуемом растворе, что позволяет не только проводить проверку в разведениях, достаточно далеко стоящих от МДР, но и иметь возможность использовать более широкую линейку чувствительности реактивов лизата амебоцитов.

       Конечно, не следует воспринимать буферные растворы, трис- и магния сульфата, как панацею, спасающую от любых проявлений ингибирования со стороны испытуемого препарата или субстанции, однако использование при подготовке исходных растворов и/или разведений испытуемого образца может быть полезным для препаратов со значением рН ниже 6,0, а также низким уровнем предельного содержания бактериальных эндотоксинов.

          И в заключении, хотелось бы отметить, что на смену зарубежным буферным растворам пришли трис-буферные растворы для ЛАЛ-теста отечественного производства. Аналогичные импортным буферные растворы производства ООО «НПО «ЛАЛ-Центр» стали более доступными как в ценовой характеристике, так и по наличию готовой продукции на складе. 

Наш трис-буфер 1 — копия.JPG

Библиография:

1. Шаповалова О.В., Неугодова Н.П., Сапожникова Г.А., Агаширинова А.А., Гунар О.В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ: МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ И ИХ УСТРАНЕНИЕ . Фармация, 2017; 66 (6): 10-14.

2. Donovan, M.A. Overcome Your Inhibitions. BioWhittaker LAL Review. Winter, 1994.


Все новости